中草药 Chinese Tr aditional and Her bal Drugs 裹作用, 使得醇沉物中留有较大量的靛玉红 。 研究 结果表明, 板蓝根醇沉物具有明显的清热解毒作用, 并对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌等的生长均有明显 的抑制作用, 其作用强度与同剂量板蓝根颗粒剂前 浸膏相当。板蓝根醇沉物中靛玉红的量明显高于 板蓝根颗粒剂前浸膏, 说明板蓝根醇沉物中含有一 定的药理活性物质。 对原料及成品的主要成分进行比较可以看出, 产品的含氮量明显高于原料。 作为饲料添加剂, 既含 有大量的蛋白质, 菌体中又富含维生素、 多种酶及辅 助因子等成分, 可为动物生长提供丰富的营养。同 时, 醇沉物经过发酵后有效成分靛玉红的质量分数 仍然高达 0. 45 Lg/ g, 残留的靛玉红也可发挥清热 解毒的作用。 醇沉物中的糖分以多糖为主, 而多数微生物只 能以小分子的单糖、 双糖作为碳源, 因此需要对其中 的多糖进行水解, 成为可发酵性糖。 多糖水解分为酶 水解和酸水解两种, 考虑到酸水解条件比较剧烈, 温 度高, 时间长, 所需 pH 值在 1. 5～1. 8, 水解结束后 调节 pH 值会带入较多的金属离子, 不利于菌体的 生长, 因此选择条件较温和的双酶法进行水解。 高质量浓度的还原糖对酵母菌生长具有抑制作 用, 应当将发酵液初始还原糖质量浓度控制在 5% 以下。在对数生长后期, 随着菌体的大量繁殖, 发酵 液中还原糖等营养物质被耗尽, 有害代谢产物不断 积累, 使得菌体的生长速率下降。 为了提高培养液中 的菌体数, 可在对数生长后期, 采用分批补料或流加 补料的方式, 向发酵液中补加还原糖, 以延长菌体的 对数生长期, 从而获得高密度培养液。 我国是中草药种植、 生产加工和消费的大国, 近 年来随着对中药资源开发力度的不断加大, 中药材 加工产生的废弃物也越来越多。这些药渣中的绝大 多数均作为废料被扔掉或烧毁, 这其中有尚未提取 完全的有效成分及未开发的新用途。本研究中探讨 了利用板蓝根醇沉物培养益生菌的方法, 不仅有效 解决了污染问题, 并且使原料资源得到了更充分合 理有效的利用, 提高了产品的附加值, 同时为采用相 R efer ences : Zhang R Z, Zhang Y W. T he res earch ing progress of indigowoad root [ J ] . Chin Tr adi t H erb Drug s ( 中草药) , 2000, 31 ( 6) : 474-476. Sun P , L i Y , Gu C Z , et al . Microwave ext ract ion and content det erm inat ion of Glycyr rhiza ural ensis Fis ch . pol ysacch aride [ J ] . Pri mary J Chi n Mater M ed ( 基层 中药杂志) , 2001, 15 ( 6) : 22-23. T ianjin Ins t it ut e of Light Indu st ry, Wuxi Inst it ut e of Light Indus t ry. Ind ustr ial F erment ati on Analysis ( 工 业 发 酵 分 析 ) [ M ] . 2nd ed . Beijing: China L ight Indu st ry Press , 1997. Du L X. T echnol ogy of Ind ustr ial M icrobiology ( 工业 微生物 技术) [M ] . T ianji n: T ianjin Science and T echnol og y Pres s, 1992. Sun T S. Cont roll ing fact ors of microorgan ic met abolis m during fermen tat ion [ J ] . Chi n Cond iment ( 中 国 调味 品 ) , 1994 ( 10) : 2-5. Hu ang J , Huang L . Improvem ent of ext ract ion process of indigowoad root g ranu le [ J ]. West Ch ina J P harm Sci ( 华西药 学杂志) , 1999, 14 ( 5-6) : 381-382. Xu Q T , Du G J, Lin H H. Phar macological st udy on alcoh ol deposit of Rad ix I satid is [J ] . Chi n H osp P harm J ( 中国医院 药学杂志) , 2003, 23 ( 10) : 587-589. 似工艺进行生产的其他中药的综合利用提供参考。
桑叶中多糖提取分离工艺的研究，优选 桑叶多糖提取分离最佳工艺。方法 比较稀酸、 稀碱、 蒸馏水 3 种提取方法, 采用 L 9 ( 3 4 ) 正交试 验, 对影响多糖的水提 取工艺和醇沉分离 工艺的因素水 平进行了 研究, 并 比较了不 同蛋白去除 法对多糖 提取分离 的影响。结果 桑叶多糖的最佳提取工艺为用 10 倍量蒸馏水 在 70 ℃下提取 2 次, 每次 1. 5 h。醇沉分离最佳工艺 为醇沉时乙醇体积分数 80% , 药液浓缩至 1 mL 药液/ g 生药, pH 值 为 4。用三 氯乙酸( T CA) 法去除 蛋白质的效果 优于传统的 Savage 法。结论 优选的桑叶多糖提取分离工艺稳定可行。
桑叶, 又名“ 铁扇子”为桑科植物桑 Morus al ba , L. 的叶, 是药食两用的中药, 始载于《 神农本草经》 , 味苦、 性寒, 归肺、 甘, 肝经, 具有疏风清热、 平肝明目 的功效。历代中医药书籍中记载桑叶能够治疗消渴 症, 现代药理研究表明桑叶多糖具有显著的降血糖 作用, 对大鼠四氧嘧啶型糖尿病有治疗效果表明葡萄糖在 20～100 Lg/ mL 与吸光度呈良好 的线性关系。 2. 2. 3 测定: 精密称取桑叶多糖提取物 50 mg, 加 水适量使溶解, 蒸馏水定容至 50 mL 量瓶中, 摇匀。 精密吸取 1 mL , 按 2. 2. 2 项下操作, 测定吸光度值, 计算多糖的质量分数。 的提取液( m) , 置于已干燥至恒重的蒸发皿中( m0 ) , 至室温, 迅速精密称定质量( mi ) , 按公式( mi - m0 ) / m×100% 计算浸膏得率。 2. 4 多糖提取工艺的优选 ,因 此提取多糖成分开发降糖新药和功能性食品具有重 要的学术意义和实用价值。本实验对桑叶不同提取 工艺所得多糖进行了比较, 采用正交试验法确定最 佳水提取和醇沉分离工艺, 并比较了不同方法去除 蛋白质的效果, 为生产提供依据。 1 材料和仪器 桑叶购于天津市安舜大药房, 所用试剂均为国 产分析纯。752 型紫外-可见分光光度计( 上海光谱 仪器有限公司) , R—201 旋转蒸发器( 上海公司) , pHS—3C 精密 pH 计( 上海雷磁仪 器 厂 ) , ALPHA 1—2 真 空 冷 冻 干 燥 机 ( 德 国 CHRiST 公司) , F A / IA 型电子天平( 上海精密科学 仪器有限公司) 。 2 方法和结果 2. 1 原料预处理: 将桑叶粉碎、 过筛, 加入一定体积 95% 乙醇, 使溶液中乙醇的体积分数达到 80% , 回 流 4 h, 间隙搅拌。回流完毕, 离心分离取滤渣, 滤渣 风干, 备用。 2. 2 桑叶多糖的测定 2. 2. 1 对照品溶液的制备: 精密称取葡萄糖对照品 ( 105 ℃干燥至恒重) 100 mg , 置于 100 mL 量瓶中, 加水适量使溶解, 稀释至刻度, 摇匀。精密吸取 10 mL 置于 100 mL 量瓶中, 加水稀释至刻度, 即得。 2. 2. 2 标准曲线的绘制: 准确吸取葡萄糖对照品溶 液 0. 05、 10、 20、 30、 40、 60、 80 mL, 用 0. 0. 0. 0. 0. 0. 蒸馏水补到 1. 00 mL。分别加入 4. 00 mL 0. 2% 蒽 酮-硫酸试剂, 迅速浸于冰水浴中冷却, 各管加完后 一起浸于沸水浴中, 管口加盖玻璃球, 以防蒸发。自 水浴重新煮沸起, 准确煮沸 10 min 取出, 自来水冷 却, 室温放置 10 min 左右。以同样处理的重蒸水为 空白, 于 620 nm 处测定。以吸光度值为纵坐标, 葡 萄糖质量浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 计算得回归 方程: Y= 0. 092 19+ 6. 546 38 X , r = 0. 999 75, 结 2. 3 浸膏得率的测定: 采用重量法。精密量取等量 水浴浓缩干, 于 105 ℃干燥 3 h, 移至干燥器中, 冷却 2. 4. 1 不同提取方法比较: 称取桑叶 50 g , 分别加 入 0. 3 mol/ L 稀盐酸溶液、 5 mol / L 稀氢氧化钠 0. 溶液、 蒸馏水, 恒温水浴中进行浸提, 离心后取上清 液, 减压浓缩后加入 95% 乙醇醇沉, 离心取沉淀, 将 沉淀用无水乙醇、 无水乙醚、 丙酮洗涤, 真空冷冻干 燥, 得桑叶多糖粗品, 测定多糖的质量分数。各自在 为提取剂, 浸提混合物浓稠, 不易离心, 加入乙醇后, 相同的条件下重复操作 3 次, 结果见表 1。 以稀碱作 溶液无明显絮状沉淀, 沉淀物不能被彻底离心, 所得 沉淀物呈黏性半溶液状。稀酸浸提混合物也比较黏 稠, 所得粗多糖的质量分数较低。可能是因为稀酸、 稀碱易使多糖发生糖苷键的断裂, 使部分多糖发生 质量分数也高, 故以蒸馏水作为提取剂。 表 1 提取方法的比较 ( n = 3) Ta ble 1 Compa rison of extr acting methods ( n= 3) 提物剂 稀 HC l 稀 NaOH 蒸馏水 多糖/ ( mg·g- 1 ) 0. 95 1. 73 1. 97 水解。 而采用蒸馏水作为提取剂较易操作, 粗多糖的 2. 4. 2 蒸馏水提取条件的优选: 影响水提取多糖工 艺的因素很多, 通过预备试验选择 4 个主要因素: 加 ( D) , 每个因素各取 3 个水平( 表 2) , 在平行操作下, 4 水 量( A ) 、 提取 时间( B) 、 提取温度 ( C) 、 提取次 数 按 L 9( 3 ) 正交试验, 以多糖的质量分数、 干浸膏得率 为提取效果的评价指标对水提取工艺条 件进行优 化, 结果见表 3。对结果进行统计学处理, 方差分析 结果见表 4。 · 536· 中草药 Chinese Tr aditional and Her bal Drugs 第 36 卷第 4 期 2005 年 4 月 表 2 工艺优化的因素水平 Table 2 Factors and levels of optimum technology 水平 A/ 倍 1 2 3 8 10 12 4 A ( 加水量) > D( 提取次数) > C( 提取温度) , B 因素 影响差异也有显著性, 直观分析表明桑叶多糖的质 因 素 B/ h 0. 5 1. 0 1. 5 C/ ℃ 70 80 90 D/ 次 1 2 3 量分数最高的工艺为 A 2B3C1, 2 D2 。综合上述两项考 察指标, 由于对干膏得率 A 2 与 A 3 相差不大, 同时 应以桑叶多糖的质量分数为主要指标, 故确定最佳 提取工艺 为 A 2B3 C1D2 , 即加 水 10 倍量, 提取时 间 表 3 L 9 ( 3 ) 正交试验结果 Table 3 Result of L 9 ( 3 ) or thogonal test 4 1. 5 h, 提取温度 70 ℃, 提取次数 2 次。 2. 5 醇沉条件的优选: 影响醇沉效果的主要因素有 - 1) 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 干 膏 k1 得 k2 率 k3 R SS K1 K2 多K 3 糖 k1 k2 k3 R SS A 1 1 1 2 2 2 3 3 3 35. 96 38. 04 38. 28 11. 99 12. 68 12. 76 0. 77 1. 08 4. 23 5. 36 3. 79 1. 41 1. 79 1. 26 0. 53 0. 44 B 1 2 3 1 2 3 1 2 3 27. 40 43. 88 41. 00 9. 13 14. 63 13. 67 5. 50 51. 64 3. 39 4. 93 5. 06 1. 13 1. 64 1. 69 0. 56 0. 58 C 1 2 3 2 3 1 3 1 2 42. 20 37. 56 32. 52 14. 07 12. 52 10. 84 3. 23 15. 62 4. 57 4. 57 4. 24 1. 52 1. 52 1. 41 0. 11 0. 02 D 1 2 3 3 1 2 2 3 1 38. 16 38. 32 35. 80 12. 72 12. 77 11. 93 0. 84 1. 32 4. 22 4. 72 4. 44 1. 41 1. 57 1. 48 0. 16 0. 04 浸膏得率 多糖 Yi/ Xi/ % 10. 48 14. 48 11. 00 8. 84 13. 44 15. 76 8. 08 15. 96 14. 24 ( m g· g 1. 01 1. 69 1. 53 1. 46 1. 79 2. 11 0. 92 1. 45 1. 42 乙 醇 体积 分 数( A ) 、 液的 浓 缩程 度 ( B) 、 值 药 pH ( C) 。以蒸馏水为提取剂, 采用水浸提最佳工艺提取 多糖, 以上述 3 个因素为考察因素, 每个因素各取 3 个水平( 表 5) , 在平行操作条件下, 按 L 9( 34) 正交设 计试验, 以多糖的质量分数作为醇沉效果的评价指 表 5 醇沉条件的因素水平 Table 5 F actor s and levels of alcohol precipitation 水平 1 2 3 因 素 A/ % 80 70 60 B/ ( mL 药液·g- 1 生药) 1 2 3 C pH 值 8 6 4 标( 表 6) 。 对结果进行统计学处理, 得方差分析( 表 7) 。 2 Xi= 112. 28 (2 X i) 2 / 9= 1 400. 76 表 6 L 9 ( 34 ) 正交试验结果 Table 6 Result of L9 ( 34 ) or thogonal test 2 Yi= 13. 38 ( 2 Yi ) 2/ 9= 19. 89 编 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 F值 显著性 K1 K2 K3 k1 k2 k3 R A 1 1 1 2 2 2 3 3 3 11. 57 8. 42 7. 74 3. 86 B 1 2 3 1 2 3 1 2 3 10. 13 9. 32 8. 28 3. 38 8. 64 9. 25 9. 84 2. 88 C 1 2 3 2 3 1 3 1 2 D( 误差) 1 2 3 3 1 2 2 3 1 9. 03 9. 35 9. 35 3. 01 3. 12 3. 12 0. 11 0. 023 0 多糖 Xi / ( mg· g- 1 生药) 3. 88 3. 92 3. 77 3. 14 2. 96 2. 32 3. 11 2. 44 2. 19 2 Xi = 27. 73 CT= ( 2 Xi ) 2/ 9= 85. 44 表 4 方差分析 Table 4 Var ia nce analysis 方差来源 浸膏 得率 A( 误差) B C D A B C( 误差) D 离差平方和 自由度 方差 1. 08 51. 64 15. 62 1. 32 0. 44 0. 58 0. 024 0. 042 2 2 2 2 2 2 2 2 0. 54 25. 82 47. 81 P < 0. 05 7. 81 14. 46 0. 66 1. 22 0. 22 18. 33 0. 29 24. 17 P < 0. 05 0. 012 0. 021 1. 75 多糖 2. 81 2. 58 1. 28 SS 2. 783 8 3. 11 3. 08 2. 76 3. 28 0. 62 0. 40 0. 573 4 0. 240 0 表 7 方差分析 Table 7 Var iance a na lyis 方差来源 A B C D( 误差) 离差平方和 2. 783 8 0. 573 4 0. 240 0 0. 023 0 自由度 2 2 2 2 方差 1. 3*** 9 0. 286 7 0. 120 0 0. 012 0 F 值 显著性 116. 00 P < 0. 01 23. 90 P < 0. 05 10. 00 F 0. 05 ( 2, 2) = 19 F 0. 01 ( 2, 2) = 99 分析可知, 以浸膏得率为评价指标, 各因素对提 取效果的影响程度依次为 B( 提取时间) > C( 提取温 度 ) > D( 提取次数) > A( 加水量) , B 因素影响差异 有显 著性, 直 观分析表 明浸膏 得率最 高的工 艺为 A 3B2C1D 2; 以桑叶多糖 的质量分数为评价 指标, 各 因素对提取效果的影响程度依次为 B( 提取时间) > F 0. 05 ( 2, 2) = 19 F 0. 01 ( 2, 2)= 99 结果分析可知, 以多糖的质量分数为评价指标, 中草药 Chinese Tr aditional and Her bal Drugs 第 36 卷第 4 期 2005 年 4 月 ·537· 各因素对醇沉效果的影响程度依次为 A ( 乙醇体积 分数) > B( 药液浓缩程度) > C( pH 值) , A 因素影响 差异有高度显著性, B 因素影响差异有显著性, 直观 分析表明多糖的质量分数最高的工艺为 A 1B1C3 , 即 醇沉时乙醇体积分数为 80% , 药液浓缩至 1 mL 药 液/ g 生药, 药液 pH 值为 4。 2. 6 验 证 试 验: 据 筛 选 所 得 最 佳 提 取 工 艺 A 2B3C1D 2 和最佳醇沉工艺 A 1B1C3, 进行正交验证试 验, 得桑叶多糖质量分数为 4. 05 mg/ g 生药( n= 3) 。 2. 7 不同蛋白去除法对多糖提取的影响: 醇沉时与 多糖一起沉淀下来的蛋白质对多糖测定值及纯度产 生很大的影响, 一般采用 Savage 法除去蛋白质, 蛋 白 质总 去除 率 可达 89. 47% , 但同 时 多糖 损 失达 37. 62% ( 表 8) , 且有大量不溶于水的颗粒沉淀物产 生和粗多糖颜色较深, 不利于粗多糖的进一步纯化。 采用三氯 乙酸( T CA) 法代替 Savage 法, 一次去除 蛋白质后, 上清液中蛋白质就降至 Savage 法 5 次除 蛋白的结果, 此时多糖的损失率仅为 12. 87% 。 实验 中还发现, 采用 TCA 法处理后溶液中的色素随着 蛋白质的沉淀而部分除去。可见用 T CA 法去除蛋 白质的效果优于传统的 Savage 法。 3 讨论 3. 1 桑叶多糖的提取中, 原料的预处理用 80% 乙 醇回流, 目的是为了除去桑叶中单糖、 双糖、 低聚糖、 苷类、 生物碱、 氨基酸及醇溶性蛋白质等物质。 表 8 Savage 法与 TCA 工艺参数比较 Table 8 Compar ison of Sava ge and TCA method par ameter 参 数 蛋白去除率/ % 多糖损失率/ % 色素去除 溶剂用量 Savage 法 89. 47 37. 62 无明显减少 正丁醇、 氯仿消耗量大 T CA 法 97. 25 12. 87 随蛋白去除而大量去除 少量三氯乙酸水溶液 3. 2 桑叶多糖的水提取和醇沉分离是不同的工艺 过程, 故对水提取和醇沉分离分别采用正交试验来 获得最佳水提取工艺和醇沉分离工艺是有必要的。 经过验证, 优选的桑叶多糖提取分离工艺稳定可行。 3. 3 水提醇沉是多糖提取中较常用的方法, 本实验 优化了水提取工艺和醇沉分离。 目前一些新技术、 新 方法如超声提取技术、 微波萃取技术、 酶法等也用于 多糖的提取分离中, 因此有必要采取这些新技术、 新 方法提取桑叶多糖并与传统方法相比较。
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